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單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素(NE)、多巴胺、5-羥色胺(5-HT)、組胺等。5-HT的代謝產(chǎn)物有5-羥吲哚乙醛,5-羥吲哚乙酸。多巴胺經(jīng)過單胺氧化酶(MAO)和兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)逐步轉(zhuǎn)化為高香草酸。NE的代謝產(chǎn)物是3-甲基-4羥-苯乙二醇。組胺的代謝產(chǎn)物有甲基組胺,咪唑乙醛,N-甲基吲哚乙酸等。
這里以組胺為例,實驗室定量檢測方法,主要包括高效液相色譜(HPLC),液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS),酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。
1.樣品前處理
稱取樣品5g放置于50ml的離心管中,加入0.4mol/L的高氯酸,振蕩搖勻1min,進行萃取,靜置,離心,衍生等過程處理。
2.色譜條件
C18的色譜柱,250mm長,4.6mm內(nèi)徑,5um粒徑,柱溫30℃;以0.01mol/L醋酸銨和乙腈為流動相,梯度洗脫,流速1ml/min,進樣量10-20uL;紫外檢測器,波長254nm。僅供參考,根據(jù)實驗環(huán)境和樣品的實際情況進行調(diào)整參數(shù)。根據(jù)出峰的結(jié)果,繼續(xù)優(yōu)化色譜條件。
3.標準曲線
稱取組胺標準品1mg,溶解于0.1mol/L的鹽酸溶液中,轉(zhuǎn)移到10ml的容量瓶中,定容至刻度,配制成0.1mg/mL的組胺標準溶液儲備液,和樣品一樣也是需要衍生化處理的。逐步梯度的稀釋成0.001,0.0025,0.005,0.01,0.015,0.025,0.05mg/mL的標準溶液。依次進樣到HPLC中測出各個濃度點的色譜峰,記錄保留時間,對峰面積進行積分,擬合標準曲線,得到回歸方程。
4.樣品含量計算
標準曲線的濃度點范圍,盡可能的覆蓋到樣品的濃度。將樣品溶液進樣到HPLC中,測出色譜圖,根據(jù)保留時間識別出組胺的色譜峰。對色譜峰進行積分處理,代入到回歸方程,是可以計算出樣品溶液的組胺含量。有的地方,需要考慮加標回收率,重復性等。