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鳥嘌呤的化學式為C5H5N5O,分子量151.126,廣泛存在于動、植物界。鳥嘌呤是一種嘌呤的衍生物,具有共軛雙鍵,是DNA和RNA的主要堿基之一,也是鳥苷酸的組成部分。從化學結構上來說,它是由一個嘧啶環(huán)和一個咪唑環(huán)稠合成的。鳥嘌呤具有多種異構體,存在于脫氧核糖核酸和核糖核酸中。鳥嘌呤的苯環(huán)上存在孤對電子,參與配位反應。鳥嘌呤主要用于科學研究,以及醫(yī)藥中間體。
檢測樣品中鳥嘌呤含量的方法,主要有高效液相色譜(HPLC)法、液相質譜聯(lián)用(LC-MS)法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。
1.高效液相色譜(HPLC)法
HPLC測定的過程,包括了前處理,色譜條件,色譜峰,原始數據,標準曲線,含量計算。
提取的方法,并非那么容易。將植物組織的樣品,進行粉碎,研磨,加入適量的有機溶劑,比如甲醇來提取鳥嘌呤。過程中呢,還會用到振蕩和超聲,從而提高提取的效率。過濾和離心,能夠讓樣品從粗糙的溶液中,更一步的去除雜質,獲得相對清澈的液體成分。一般情況下,成了液體是不是就可以直接測了呢?其實,也不一定的。這個要看情況的。通常情況下,經過了離心和膜過濾,也需要進行干燥處理,然后進一步的溶解,利于后續(xù)的HPLC測定。用什么溶劑溶解,這是比較重要的,一般選擇流動相中的溶劑,比如乙腈或水。
色譜條件:常用的C18反相色譜柱,柱溫25-30℃;流動相有用乙酸-乙腈-甲醇的,也有用磷酸二氫鉀的,流速1.0ml/min,進樣量10-20ul;紫外檢測器,波長待定,根據實際情況,調整對應的參數,讓峰出的更完善,更有效,結果會更準確的。
標準曲線:一般情況下,HPLC測含量,常用到內標和外標法。而標準曲線,就是外標法,常規(guī)的情況下使用。將標準品,按要求進行溶解,成倍的,梯度的稀釋,至少6個點的濃度。按設置好的參數進行測定,記錄色譜峰,對面積進行積分。以標準品的濃度為橫坐標,對應色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程。
根據回歸方程,是可以得到含量的。但是,為了更準確的得到計算結果,需要確保相關系數r2>0.999,重復性要符合要求。不能忽略的是回收率,稀釋倍數。
2.液相質譜聯(lián)用(LC-MS)法
LC-MS結合了液相出色的分離能力,加上質譜的定性定量分析,就可以將鳥嘌呤從本質上進行確定含量。它適合于復雜樣品中的鳥嘌呤含量測定,甚至還能對代謝物也能精確分析。是不是很厲害啊,雖然有優(yōu)點,卻需要對方法有充分的了解,設備比較貴。