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GABA別名是4-氨基丁酸,化學(xué)式為C4H9NO2,分子量為103.1,能溶于水,不溶于苯,乙醚等。是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,廣泛存在于脊椎動(dòng)物,植物和微生物中。常用溶劑萃取,柱分離制備,也有微生物發(fā)酵。在植物的生理代謝過程中,具有抗逆和調(diào)控作用。
檢測方法:高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜(GC)法、質(zhì)譜(MS)法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。
1.高效液相色譜法
樣品處理:稱取組織-加入裂解液-勻漿-超聲-離心-取上清-過濾。
色譜條件:C18的色譜柱,柱溫一般為30-40℃或指定的溫度。流動(dòng)相一般用甲醇和乙腈,或乙腈和三水合乙酸鈉,流速為1.0ml/min,根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。紫外檢測器,波長為338或248nm,在實(shí)際測定的過程中,需要進(jìn)行方法驗(yàn)證,確定最佳的檢測波長。進(jìn)樣量為10uL,進(jìn)樣測定。
標(biāo)準(zhǔn)曲線:將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋,成倍的,梯度稀釋至少6個(gè)濃度。這幾個(gè)濃度點(diǎn)要覆蓋到檢測器的最佳的檢測范圍之內(nèi),測定出來的色譜峰,對峰面積進(jìn)行積分,結(jié)合對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,可以繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。相關(guān)系數(shù)r2一般情況要大于0.999,重復(fù)性符合要求。方法學(xué)上,需要考慮回收率。
樣品測定:樣品的測定條件和標(biāo)準(zhǔn)品是一樣的,記錄出峰的情況。對色譜峰面積進(jìn)行積分,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,是可以計(jì)算出樣品的GABA含量。
2.氣相色譜(GC)法
樣品處理:前面的方法也是裂解-勻漿,接著是丙酮沉淀蛋白,離心取上清。不同的是,使用GC測GABA含量,是需要對樣品的殘留提取物進(jìn)行衍生化處理,比如與10%乙酰氯異丙醇液和三氟醋酐進(jìn)行酯化和?;磻?yīng),生成GABA衍生物。
色譜條件:使用毛細(xì)管色譜柱,氫火焰離子化檢測器。主要的是設(shè)置進(jìn)樣溫度,柱溫,梯度升溫,載氣氮?dú)饬魉?,進(jìn)樣分流比,空氣或氫氣壓力等。
同樣,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,計(jì)算出樣品中的GABA含量??梢詤⒖嘉墨I(xiàn),根據(jù)對應(yīng)的方法測定。
3.質(zhì)譜(MS)法
質(zhì)譜一般是和液相或氣相聯(lián)合使用的,在前期的處理后,在色譜柱和流動(dòng)相的分離提取,進(jìn)入質(zhì)譜離子源,形成碎片離子。在質(zhì)譜的質(zhì)量分析器內(nèi),電磁場的作用下,根據(jù)質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離,并到達(dá)最終的檢測器上,形成質(zhì)譜峰。對質(zhì)譜峰進(jìn)行解析,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以更準(zhǔn)確的定量。
4.酶聯(lián)免疫吸附法
采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。往預(yù)先包被γ氨基丁酸(GABA)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在濃酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的γ氨基丁酸(GABA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。