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色氨酸的代謝產(chǎn)物主要包括5-羥色胺(5-HT),煙酸(維生素B3),犬尿氨酸及衍生物,褪黑素,吲哚類衍生物(吲哚-3-丙酸,吲哚-3-乙酸等)。其中,5-HT是色氨酸經(jīng)過色氨酸羧化酶催化生成5-羥色氨酸,再脫羧而形成的。煙酸是色氨酸由犬尿氨酸途徑轉(zhuǎn)化而來的,褪黑素是5-HT經(jīng)過乙?;图谆傻?,腸道菌群可將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酸等吲哚類衍生物。
以吲哚-3-丙酸為例,可簡稱為吲哚丙酸,一般是采用高效液相色譜(HPLC)或液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)測定含量的。
吲哚丙酸是由1個吲哚環(huán)和1個丙酸基團組成的,吲哚環(huán)能讓它具有反應(yīng)活性,丙酸基團讓它有了酸性和一些特定的化學(xué)性質(zhì)。化學(xué)式為C11H11NO2,微溶于水,易溶于有機溶劑如乙醇,乙醚,氯仿等。以HPLC為例,簡單的介紹一下測定過程。
1.樣品處理
將植物組織樣本進行粉碎和研磨,采用適合的有機溶劑如甲醇,乙腈等,并采取超聲,離心,過濾等一系列的提取操作。比如,0.45um膜過濾,待測。
2.色譜條件
一般采用C18的色譜柱,250mm長,4.6mm內(nèi)徑,5um粒徑;柱溫25-30℃。用甲醇和水或乙腈和水為流動相,根據(jù)出峰情況調(diào)整流動相比例。流速1ml/min,進樣量10uL,紫外檢測器,波長280nm。僅供參考。
3.標準曲線
將吲哚丙酸的標準品用甲醇溶解,并梯度稀釋5-7個濃度點。一般最低點為定量限,信噪比(S/N)的10倍,最高點要覆蓋到樣本溶液可能得范圍。調(diào)整好儀器設(shè)備參數(shù),穩(wěn)定好狀態(tài),依次進樣HPLC,測出色譜峰。記錄它的保留時間和峰面積,通過峰面積和對應(yīng)濃度的關(guān)系,擬合出標準曲線,得到回歸方程。為了確保線性的準確性,相關(guān)系數(shù)R2要大于0.999,越接近1越好。
4.樣品測定
進樣HPLC中,得到色譜圖,根據(jù)保留時間識別出目標色譜峰。對它的面積進行積分,代入到回歸方程,計算出樣品溶液中的吲哚丙酸含量。這個只是粉碎,研磨,超聲,離心,過濾之后的溶液中的含量。如果要知道樣品中的含量,還需要根據(jù)稀釋倍數(shù),逐步還原到樣本組織時候的含量。這個一般是有公式計算出來的。